Cell | 免疫反应如何“换挡”？研究揭示IRF1接管IRF2转录控制权的关键机制

引言

一种转录因子，既能促进炎症相关基因表达，又能防止组织发生严重炎症——这听起来似乎有些矛盾。

一个反常识现象：少了IRF2，炎症反而更强了

理解这项研究，首先要认识一类重要的免疫基因——干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，）。

当细胞遭遇病毒或细菌时，模式识别受体（pattern recognition receptors，

这些基因对于抗感染非常重要，但持续、过量表达同样可能造成组织损伤。

IRF2长期以来被认为具有抑制炎症的功能。研究中的Irf2缺失小鼠在大约8周龄开始出现脱毛，到了12～20周龄发展为严重皮炎。

研究人员进一步对皮肤进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，

有趣的是，这些细胞并没有表现出与之匹配的IFN-β或IFN-α明显升高。

也就是说，细胞似乎在没有大量增加干扰素的情况下，就已经启动了一套很强的“干扰素样”基因表达程序。

答案指向IRF1。

删除IRF1后，296个异常升高的ISG几乎被“拉回原位”

研究人员进一步构建了同时缺失Irf1和Irf2的小鼠。

结果非常直接。

在Irf2缺失皮肤中升高的296个ISG，在进一步删除Irf1后，其异常表达全部得到恢复。与此同时，Irf1和Irf2双缺失小鼠没有出现Irf2单独缺失小鼠所表现出的典型皮肤病变。

这个结果改变了理解IRF2功能的角度。

IRF2或许并不是一个经典意义上的“转录抑制因子”。它可能本身也在促进转录，只不过它的转录激活能力比IRF1弱。

于是，一个看似矛盾的现象就变得容易理解了。

正常情况下，IRF2占据某些DNA调控区域，维持一个相对温和的转录状态；IRF2一旦消失，活性更强的IRF1接管这些位点，ISG表达随之被放大。

这并不是简单的“开”和“关”，而是弱激活状态向强激活状态的转换。

725个IRF1结合位点中，93%已经被IRF2占据

这一假设得到了染色质层面的支持。

研究人员在未刺激的骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，

结果检测到：

更关键的是，在725个IRF1结合位点中，有676个同时存在IRF2结合，占93%。重新计算一下，676÷725约为93.2%，与论文报告一致。

这676个位点中，496个位于增强子区域，180个位于启动子区域，其中包括Gbp2、Ifit1和Zbp1等典型ISG相关位点。

当IRF2缺失后，这些区域出现了一系列一致变化。

代表活跃启动子和增强子的组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27 acetylation，H3K27ac）增加；转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin sequencing，ATAC-seq）显示染色质开放程度增加；与此同时，IRF1结合也增强。

值得注意的是，IRF2结合并没有伴随典型抑制性染色质标记H3K27me3或H3K9me3富集。

更合理的解释是，IRF2本身是一个转录激活因子，只是它在这些位点上的激活能力弱于IRF1。因此，IRF2占据这些区域时，客观上限制了IRF1产生更强的转录输出。

但这里还有一个容易被过度简化的地方。

IRF1和IRF2并不一定只是在DNA上“抢位置”。研究人员进行DNA结合实验时，观察到了IRF1-IRF2-DNA复合物，提示两者在某些条件下可能存在一定协同性。

因此，这个系统比简单的竞争模型更加复杂。

细菌信号一来，细胞同时做两件事：增加IRF1，减少IRF2

如果IRF2在静息状态下限制IRF1，那么免疫反应启动时，细胞怎样完成控制权切换？

研究人员用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬细胞。LPS通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）激活先天免疫。

刺激后出现了一个非常清晰的变化：

但Irf2的mRNA并没有明显下降。

这意味着IRF2减少不是因为细胞“不再生产它”，而更可能是因为已有的IRF2蛋白被主动清除。

研究人员随后加入蛋白酶体抑制剂MG-132，IRF2的下降被阻止；使用MLN4924抑制Cullin家族E3泛素连接酶后，IRF2同样得以保留。

由此，IRF2蛋白减少被定位到泛素-蛋白酶体降解系统（ubiquitin-proteasome system）。

而且这并非LPS特有。

TLR3激动剂poly(I:C)、TLR1/2激动剂Pam3CSK4、TLR7激动剂Imiquimod以及IFN-γ，都能够诱导IRF2下降。

换句话说，多个先天免疫刺激最终都可以推动一个共同方向：

IRF1增加，IRF2减少。

更重要的是：这条通路可以先于干扰素启动

这项研究中一个很值得关注的发现，是IRF1介导的ISG激活并不完全依赖经典的IFN-JAK-STAT通路。

研究人员使用JAK抑制剂ruxolitinib和baricitinib阻断信号。

药物能够有效阻断STAT1磷酸化，但并没有阻止LPS诱导IRF1，也没有阻止IRF2降解。

更有意思的是，ruxolitinib虽然明显降低了ISG表达，却没有把ISG表达完全消除；只有在阻断JAK信号的同时缺失IRF1，ISG诱导才进一步受到强烈抑制。

因此，研究提出了一个“两阶段”模型。

这意味着我们熟悉的“先产生干扰素，再启动ISG”并不是唯一顺序。

在某些先天免疫场景中，ISG程序可以在完整的干扰素旁分泌环路建立之前就开始启动。

谁负责清除IRF2？答案是SPOP，但过程比想象中更巧妙

接下来是整项研究最重要的机制之一。

既然IRF2需要经过Cullin E3泛素连接酶系统降解，具体是谁在识别它？

研究人员首先发现，删除Cullin-3（CUL3）可以阻止LPS诱导的IRF2下降。

CUL3需要底物适配蛋白帮助识别降解目标。研究人员进一步筛选了巨噬细胞中表达较高的18种CUL3底物适配蛋白，结果只有删除SPOP（speckle-type POZ protein）能够明显阻止IRF2降解。

但一个意外情况出现了：

SPOP能够与IRF1发生共免疫沉淀，而研究人员没有检测到SPOP与IRF2稳定结合。

也就是说，SPOP似乎并不是简单地找到IRF2，然后直接把它送入蛋白酶体。

研究进一步显示，当Irf1缺失时，即使细胞仍表达SPOP，LPS刺激之后IRF2也不会正常下降。

反过来，在Irf1缺失细胞中重新导入Irf1 mRNA，1小时后IRF1大量表达，2小时后IRF2开始明显减少。而在缺失SPOP的细胞中，即使重新表达IRF1，也不能有效诱导IRF2下降。

IRF1增加之后，它与SPOP形成联系，并把SPOP带到IRF2所在的基因调控区域，随后通过CUL3-SPOP相关的泛素-蛋白酶体系统促进IRF2清除。

于是，IRF1实际上同时完成了两件事：

一方面加强自己的转录作用，另一方面推动原有IRF2控制状态退出。

IFN-β带来了另一个转折：IRF2不是只会“消失”，还会重新分布

故事到这里还没有结束。

当细胞受到IFN-β刺激时，IRF1同样会上升，但研究人员最初并没有看到IRF2蛋白明显减少。

原因并不是IRF2没有被降解。

实验显示，IFN-β仍会促进IRF2经蛋白酶体降解，只不过与此同时，IRF9又促进了Irf2基因转录，使新合成的IRF2补充进来，从整体蛋白水平上“掩盖”了降解过程。

染色质分析进一步发现，IFN-β刺激之后，IRF2在基因组中的位置也发生了重新分配。

有443个位点的IRF2结合减少，同时1429个位点的结合增加。

结合减少的区域通常只有2～3个IRF基序重复，并较多分布于先天免疫基因启动子；而结合增加区域平均含有约11个IRF基序重复，部分位点甚至达到60～80个重复。

因此，在IFN-β条件下，细胞并不只是通过“降解IRF2”完成转换，还可能把IRF2从部分ISG启动子重新分配到其他远端基因组区域。

这使IRF1和IRF9更容易在关键ISG调控区域发挥作用。

SPOP缺失揭示了另一件事：IRF2并不是越多越“抗炎”

如果SPOP负责帮助控制IRF2，那么没有SPOP会发生什么？

答案并不是简单的“IRF2增加，因此ISG下降”。

LPS刺激后，SPOP缺失巨噬细胞中有242个基因组区域的IRF2结合发生改变，其中224个、也就是约92%，表现为IRF2结合增加。

转录组分析则发现124个差异表达基因，其中105个上调、19个下调。

研究人员通过CUT&RUN检测到了4422个SPOP基因组结合位点；LPS刺激后，其中316个位点的SPOP占据增加。这些增加位点中，有207个、约66%同时出现IRF2信号。

功能上，SPOP缺失巨噬细胞受到细菌成分刺激后，会释放更多CCL2、CCL7、CXCL1和IL-22，但IL-6和TNF并没有相应增加。

这说明SPOP并不是一个简单的“总炎症开关”。

它更像是在特定染色质区域控制IRF1和IRF2蛋白稳定性，从而避免某些细胞因子（cytokines）和趋化因子（chemokines）出现异常表达。

这里也进一步解释了IRF2最初的悖论：

一个转录因子究竟表现为“促炎”还是“抗炎”，取决于它在哪里、与谁共同存在，以及当时细胞处于什么信号环境。

这项研究值得关注的，不是又找到了一条信号通路

如果只把这项研究概括成“IRF1-SPOP促进IRF2降解”，其实会错过它更值得思考的部分。

传统上，我们很容易把转录因子分类成“激活因子”和“抑制因子”。

但这项研究展示了另一种调控逻辑：

IRF2不必主动把染色质关闭，只要它长期占据某些调控区域，并产生比IRF1弱的转录输出，就能够把整个系统维持在较低水平。

当TLR信号到来后，细胞同时提高IRF1水平并降低IRF2稳定性，使调控系统迅速转换到高输出状态。

从这个角度看，免疫反应的调节并不仅取决于“某个因子有没有”，还取决于谁正在占据调控区域、不同转录因子的相对丰度、蛋白稳定性以及它们出现的时间顺序。

这也是为什么时间维度在免疫信号研究中如此重要。

同一个基因组位点，在静息状态、TLR刺激早期和IFN信号建立之后，可能处于完全不同的转录因子组合之下。

仍有一个关键问题没有答案：为什么IRF1比IRF2更强？

这项研究建立了一个相当完整的机制框架，但并没有回答所有问题。

研究人员明确指出，目前虽然有充分证据表明IRF1在这些ISG调控区域上的转录激活能力强于IRF2，却缺少生化证据解释这种差异究竟来自哪里。一种可能性是IRF1和IRF2招募了不同的共激活因子（co-activators），但目前仍属于假设。

此外，人源实验主要集中在原代单核细胞来源巨噬细胞。IRF1-IRF2调控回路在其他人类细胞，尤其是非髓系细胞中的作用，目前仍不清楚。

研究也没有直接证明，在SPOP缺失动物中，IRF1和IRF2稳定性的变化究竟在多大程度上决定整体炎症表型。

所以，这项工作更适合被理解为：

不过，它已经提出了一个值得继续关注的问题：

当我们观察一个免疫基因“表达升高”时，我们是否应该只寻找哪个信号通路被激活？

还是应该进一步问——

在这个基因的调控区域上，究竟是谁被换掉了？

有时，决定免疫反应强弱的，不是有没有按下一个新的开关，而是转录控制权在什么时候，从谁的手里转移到了谁的手里。

参考文献